抗虫耐除草剂玉米BBL2-2实时荧光定量PCR检测方法的建立

doi:10.19586/j.2095-2341.2026.0041

生物技术进展 ›› 2026, Vol. 16 ›› Issue (4): 853-862.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2026.0041

抗虫耐除草剂玉米BBL2-2实时荧光定量PCR检测方法的建立

董美¹(), 孟丽霞¹, 文婷婷¹, 苗朝华¹, 金芜军¹^,²()

^1.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081
^2.三亚中国农业科学院国家南繁研究院，海南三亚 572024

收稿日期:2026-02-27 接受日期:2026-03-10 出版日期:2026-07-25 发布日期:2026-09-11
通信作者: 金芜军
作者简介:董美 E-mail: dmei2010@126.com；
基金资助:
国家重点研发计划项目(2023YFF1001600);海南省重点研发计划项目(ZDYF2025GXJS151)

Establishment of a Real-time Quantitative PCR Detection Method for Insect-resistant and Herbicide-tolerant Maize BBL2-2

Mei DONG¹(), Lixia MENG¹, Tingting WEN¹, Chaohua MIAO¹, Wujun JIN¹^,²()

^1.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China
^2.National Nanfan Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Hainan Sanya 572024，China

Received:2026-02-27 Accepted:2026-03-10 Online:2026-07-25 Published:2026-09-11
Contact: Wujun JIN

摘要/Abstract

摘要：

我国转基因玉米推广迅速，是获得最多转基因生物安全证书的粮食作物，因此针对转基因玉米品系建立特异、灵敏、可操作的检测方法是十分必要的。根据抗虫耐除草剂玉米BBL2-2转化体旁侧序列设计特异性引物探针，建立了BBL2-2玉米转化体实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有良好的特异性；检出限可以达到0.05%（20拷贝），定量限可以达到0.1%（40拷贝）；标准曲线线性度良好，方法的正确度和精密度均≤25%，符合相关标准要求；实验室间验证与内部测试结果相符，展现了良好的重复性和再现性；不确定度的评定方法可操作性强，既确保了定量结果的可靠性，也为标识阈值管理提供了依据。研究建立的抗虫耐除草剂玉米BBL2-2实时荧光定量PCR检测方法为该品系转基因玉米的商业化推广提供了检测和监管等技术支撑。

关键词: BBL2-2玉米, 转化体特异性PCR, 定量检测, 实验室间验证, 不确定度

Abstract:

The adoption of genetically modified （GM） maize has expanded rapidly in China， and it has become the crop with the highest number of safety certificates issued for genetically modified organisms （GMOs）. Therefore， it is essential to establish a specific， sensitive， and operable detection method for GM maize lines. This study designed specific primer-probe sets based on the flanking sequences of the insect-resistant and herbicide-tolerant maize event BBL2-2， establishing a real-time quantitative PCR detection method for this event. The method exhibited high specificity. Its limit of detection （LOD） reached 0.05% （equivalent to 20 copies）， and the limit of quantification （LOQ） reached 0.1% （equivalent to 40 copies）. The standard curve showed excellent linearity， and both the trueness and precision of the method were ≤25%， complying with relevant standard requirements. Inter-laboratory validation results were consistent with internal test results， demonstrating good repeatability and reproducibility. The established uncertainty assessment method was highly operable， ensuring the reliability of quantitative results and providing a basis for labeling threshold management. The developed real-time quantitative PCR detection method for insect-resistant and herbicide-tolerant maize BBL2-2 offers technical support for detection and regulatory oversight， facilitating the commercial deployment of this GM maize event.

Key words: BBL2-2 maize, event-specific PCR, quantitative detection, inter-laboratory validation, uncertainty

中图分类号:

Q786

董美, 孟丽霞, 文婷婷, 苗朝华, 金芜军. 抗虫耐除草剂玉米BBL2-2实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 生物技术进展, 2026, 16(4): 853-862.

Mei DONG, Lixia MENG, Tingting WEN, Chaohua MIAO, Wujun JIN. Establishment of a Real-time Quantitative PCR Detection Method for Insect-resistant and Herbicide-tolerant Maize BBL2-2[J]. Current Biotechnology, 2026, 16(4): 853-862.

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链接本文: https://swjsjz.magtechjournal.com/CN/10.19586/j.2095-2341.2026.0041

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图/表 13

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编号	引物探针组合	引物序列（5'→3'）	探针序列（5'→3'）	扩增片段大小/bp
1	5'F2/5'R1/5'P	5'F2：5'-CGGCGGTCAACCAAACAA-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	165
1	5'F2/5'R1/5'P	5'R1：5'-ACATTAAAAACGTCCGCAAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	165
2	5'F3/5'R1/5'P	5'F3：5'-GTGATCTTGTTCGTTGTATTGG-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	102
2	5'F3/5'R1/5'P	5'R1：5'-ACATTAAAAACGTCCGCAAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	102
3	5'F2/5'R2/5'P	5'F2：5'-CGGCGGTCAACCAAACAA-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	182
3	5'F2/5'R2/5'P	5'R2：5'-TTCGGCGTTAATTCAGTACAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	182
4	5'F3/5'R2/5'P	5'F3：5'-GTGATCTTGTTCGTTGTATTGG-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	119
4	5'F3/5'R2/5'P	5'R2：5'-TTCGGCGTTAATTCAGTACAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	119
5	3'F1/3'R2/3'P	3'F1：5'-TTTTATGATTAGAGTCCCGCA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	163
5	3'F1/3'R2/3'P	3'R2：5'-TGCAGCTTTTGTTGACCTAA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	163
6	3'F2/3'R2/3'P	3'F2：5'-CGTTATTTATGAGATGGGTTTTT-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	182
6	3'F2/3'R2/3'P	3'R2：5'-TGCAGCTTTTGTTGACCTAA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	182
7	3'F3/3'R2/3'P	3'F3：5'-GCGATAGAAAACAAAATATAGCG-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	126
7	3'F3/3'R2/3'P	3'R2：5'-TGCAGCTTTTGTTGACCTAA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	126
8	3'F1/3'R3/3'P	3'F1：5'-TTTTATGATTAGAGTCCCGCA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	183
8	3'F1/3'R3/3'P	3'R3：5'-CTAGTATCGCAAAAGGTCGG-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	183

编号	引物探针组合	引物序列（5'→3'）	探针序列（5'→3'）	扩增片段大小/bp
1	5'F2/5'R1/5'P	5'F2：5'-CGGCGGTCAACCAAACAA-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	165
1	5'F2/5'R1/5'P	5'R1：5'-ACATTAAAAACGTCCGCAAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	165
2	5'F3/5'R1/5'P	5'F3：5'-GTGATCTTGTTCGTTGTATTGG-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	102
2	5'F3/5'R1/5'P	5'R1：5'-ACATTAAAAACGTCCGCAAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	102
3	5'F2/5'R2/5'P	5'F2：5'-CGGCGGTCAACCAAACAA-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	182
3	5'F2/5'R2/5'P	5'R2：5'-TTCGGCGTTAATTCAGTACAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	182
4	5'F3/5'R2/5'P	5'F3：5'-GTGATCTTGTTCGTTGTATTGG-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	119
4	5'F3/5'R2/5'P	5'R2：5'-TTCGGCGTTAATTCAGTACAT-3'	5'P：5'-FAM-TCCCTGAGAGTCAACTGCCCC-BHQ1-3'	119
5	3'F1/3'R2/3'P	3'F1：5'-TTTTATGATTAGAGTCCCGCA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	163
5	3'F1/3'R2/3'P	3'R2：5'-TGCAGCTTTTGTTGACCTAA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	163
6	3'F2/3'R2/3'P	3'F2：5'-CGTTATTTATGAGATGGGTTTTT-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	182
6	3'F2/3'R2/3'P	3'R2：5'-TGCAGCTTTTGTTGACCTAA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	182
7	3'F3/3'R2/3'P	3'F3：5'-GCGATAGAAAACAAAATATAGCG-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	126
7	3'F3/3'R2/3'P	3'R2：5'-TGCAGCTTTTGTTGACCTAA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	126
8	3'F1/3'R3/3'P	3'F1：5'-TTTTATGATTAGAGTCCCGCA-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	183
8	3'F1/3'R3/3'P	3'R3：5'-CTAGTATCGCAAAAGGTCGG-3'	3'P：5'-FAM-TTACTAGATCGGG AATTAAACTATCAGTG-BHQ1-3'	183

重复	BBL2-2转化体拷贝数	zSSIIb基因拷贝数	测量值/%
1	29.90	28 300.00	0.106
2	24.50	24 900.00	0.099
3	31.50	28 900.00	0.109
4	26.80	26 800.00	0.100
5	26.70	26 600.00	0.100
6	27.90	27 300.00	0.102
7	26.80	26 200.00	0.102
8	29.00	28 100.00	0.103
9	25.30	25 000.00	0.101
10	25.50	25 500.00	0.100
11	26.50	27 000.00	0.098
12	26.80	27 000.00	0.099
13	27.60	27 200.00	0.102
14	26.80	26 800.00	0.100
15	27.60	27 300.00	0.101
平均测量值（%）	/	/	0.101
相对偏倚（%）	/	/	1.000
标准差	/	/	0.003
相对标准差（%）	/	/	2.809

重复	BBL2-2转化体拷贝数	zSSIIb基因拷贝数	测量值/%
1	29.90	28 300.00	0.106
2	24.50	24 900.00	0.099
3	31.50	28 900.00	0.109
4	26.80	26 800.00	0.100
5	26.70	26 600.00	0.100
6	27.90	27 300.00	0.102
7	26.80	26 200.00	0.102
8	29.00	28 100.00	0.103
9	25.30	25 000.00	0.101
10	25.50	25 500.00	0.100
11	26.50	27 000.00	0.098
12	26.80	27 000.00	0.099
13	27.60	27 200.00	0.102
14	26.80	26 800.00	0.100
15	27.60	27 300.00	0.101
平均测量值（%）	/	/	0.101
相对偏倚（%）	/	/	1.000
标准差	/	/	0.003
相对标准差（%）	/	/	2.809

重复	BBL2-2转化体			zSSIIb基因
重复	曲线斜率	决定系数	扩增效率	曲线斜率	决定系数	扩增效率
1	-3.383	0.999	97.530%	-3.462	0.996	94.450%
2	-3.422	0.999	95.980%	-3.384	0.999	97.490%
3	-3.515	0.998	92.525%	-3.305	1.000	100.724%
平均值	-3.440	0.999	95.345%	-3.384	0.998	97.555%

抗虫耐除草剂玉米BBL2-2实时荧光定量PCR检测方法的建立

Establishment of a Real-time Quantitative PCR Detection Method for Insect-resistant and Herbicide-tolerant Maize BBL2-2

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样品含量/%	各平行子样转基因含量/%			平均值/%	相对偏倚/%	标准差	相对标准差/%
样品含量/%	子样1	子样2	子样3	平均值/%	相对偏倚/%	标准差	相对标准差/%
5.0	5.03	4.85	5.00	4.96	-0.80	0.10	1.94
3.0	3.00	3.00	3.02	3.01	0.33	0.01	0.38
1.0	0.98	0.99	1.04	1.00	0.00	0.03	3.20
0.5	0.47	0.48	0.50	0.48	-4.00	0.02	3.16
0.1	0.10	0.10	0.10	0.10	0.00	0.00	0.00

因素	样品测试结果/%			平均测量值/%	相对偏倚/%	标准差	相对标准差/%
因素	1	2	3	平均测量值/%	相对偏倚/%	标准差	相对标准差/%
不同操作者	0.97	0.96	0.95	0.96	-4.00	0.01	1.04
不同试剂盒	0.96	0.97	0.97	0.97	-3.00	0.01	0.60
不同仪器	1.03	1.00	0.98	1.00	0.00	0.03	2.51

实验室	PCR板序号	zSSIIb基因			BBL2-2转化体
实验室	PCR板序号	曲线斜率	决定系数	扩增效率/%	曲线斜率	决定系数	扩增效率/%
Lab 1	1	-3.220	0.999	104.400	-3.363	0.997	98.300
	2	-3.151	0.999	107.700	-3.330	0.998	99.700
	3	-3.409	0.995	96.500	-3.277	0.998	101.900
Lab 2	1	-3.287	0.998	101.474	-3.367	0.991	98.161
	2	-3.370	0.998	98.032	-3.169	0.996	106.784
	3	-3.322	0.992	99.993	-3.299	0.999	100.962
Lab 3	1	-3.498	0.999	93.100	-3.486	0.99	93.600
	2	-3.465	0.997	94.400	-3.434	0.998	95.500
	3	-3.437	0.998	95.400	-3.432	0.999	95.600
Lab 4	1	-3.171	0.998	106.727	-3.253	0.998	102.981
	2	-3.113	0.995	109.509	-3.188	0.996	105.895
	3	-3.214	0.984	104.710	-3.183	0.995	106.124
Lab 5	1	-3.367	0.998	98.149	-3.341	0.997	99.202
	2	-3.285	0.998	101.560	-3.292	0.998	101.256
	3	-3.338	0.999	99.346	-3.346	0.999	99.009
Lab 6	1	-3.139	0.999	108.200	-3.195	0.999	105.600
	2	-3.194	0.999	105.600	-3.171	0.999	106.700
	3	-3.147	0.999	107.800	-3.195	0.999	105.600
Lab 7	1	-3.308	0.995	100.600	-3.395	0.997	97.000
	2	-3.345	0.996	99.100	-3.464	0.992	94.400
	3	-3.394	0.996	97.100	-3.253	0.993	103.000
Lab 8	1	-3.459	0.998	94.577	-3.450	0.998	94.908
	2	-3.375	0.998	97.844	-3.422	0.999	95.983
	3	-3.258	0.997	102.726	-3.492	0.997	93.372

转基因标称值/%	5.0	3.0	1.0	0.5	0.1
检测总平均值	4.935	2.803	0.905	0.463	0.099
重复性标准差	0.163 2	0.101 9	0.049 7	0.021 1	0.007 9
重复性相对标准差/%	3.308	3.633	5.497	4.550	7.960
再现性标准差	0.330 4	0.203 4	0.088 1	0.049 0	0.009 4
再现性相对标准差/%	6.695	7.254	9.742	10.583	9.493

[1]	贾艳艳, 端木路阳. 关于数字PCR扩增过程中气泡产生机理及抑制方法研究[J]. 生物技术进展, 2025, 15(4): 693-701.
[2]	赵薇萍, 齐艺惠, 李晶晶, 宋爽, 翟睿, 杜茜茜. 改良1,9-二甲基亚甲基蓝法定量检测岩藻多糖[J]. 生物技术进展, 2023, 13(5): 779-784.
[3]	缪青梅,赵杨,徐晓丽,徐俊锋,汪小福,陈笑芸. 转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33转化体特异性检测方法的建立[J]. 生物技术进展, 2020, 10(6): 696-703.
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样品名称	BBL2-2转化体特异性序列重复测定结果
	子样1			子样2			子样3
	重复1	重复2	重复3	重复1	重复2	重复3	重复1	重复2	重复3
空白对照	-	/	/	-	/	/	-	/	/
阴性对照	-	/	/	-	/	/	-	/	/
阳性对照	+	/	/	+	/	/	+	/	/
1% BBL2-2玉米	+	+	+	+	+	+	+	+	+
其他转基因玉米混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因大豆混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因水稻混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因棉花混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因油菜混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
非转基因玉米混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
0.05% BBL2-2玉米	+	+	+	+	+	+	+	+	+

样品名称	BBL2-2转化体特异性序列重复测定结果
	子样1			子样2			子样3
	重复1	重复2	重复3	重复1	重复2	重复3	重复1	重复2	重复3
空白对照	-	/	/	-	/	/	-	/	/
阴性对照	-	/	/	-	/	/	-	/	/
阳性对照	+	/	/	+	/	/	+	/	/
1% BBL2-2玉米	+	+	+	+	+	+	+	+	+
其他转基因玉米混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因大豆混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因水稻混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因棉花混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因油菜混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
非转基因玉米混合样	-	-	-	-	-	-	-	-	-
0.05% BBL2-2玉米	+	+	+	+	+	+	+	+	+