转基因大豆多靶标筛查质粒DNA标准分子的研制

doi:10.19586/j.2095-2341.2026.0029

生物技术进展 ›› 2026, Vol. 16 ›› Issue (4): 863-877.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2026.0029

转基因大豆多靶标筛查质粒DNA标准分子的研制

刘鹏飞¹(), 刘娜¹, 李瑞环¹, 付伟², 徐超¹, 兰青阔¹, 王永¹, 赵新¹()

^1.天津市农业科学院种质资源与生物技术研究所，天津 300384
^2.农业农村部科技发展中心，北京 100176

收稿日期:2026-02-09 接受日期:2026-03-13 出版日期:2026-07-25 发布日期:2026-09-11
通信作者: 赵新
作者简介:刘鹏飞E-mail: swkxlpf@163.com；
基金资助:
国家科技重大专项(2022ZD04020)

Development of Multi-target Plasmid DNA Reference Materials for Screening Transgenic Soybeans

Pengfei LIU¹(), Na LIU¹, Ruihuan LI¹, Wei FU², Chao XU¹, Qingkuo LAN¹, Yong WANG¹, Xin ZHAO¹()

^1.Institute of Germplasm Resources and Biotechnologe，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300384，China
^2.Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China

Received:2026-02-09 Accepted:2026-03-13 Online:2026-07-25 Published:2026-09-11
Contact: Xin ZHAO

摘要/Abstract

摘要：

大豆不仅含有丰富的植物蛋白和食用油脂，还含有异黄酮、卵磷脂等有益营养物质，是重要的食用、饲用和油料作物。我国大豆需求量和进口量逐年增加，大豆进口依存度长期在80%以上。以我国自主研发并获得转基因生物安全证书的5种转基因大豆（DBN9004、DBN8002、SHZD32-1、中黄6106和CAL16）为研究对象，依托各转化体及其衍生品种定性和定量检测方法的标准，将以上5种转基因大豆及大豆内标准基因Lectin聚合构建到双元载体骨架上，开展了质粒分子验证、质粒保存介质的筛选、验证方法特异性、检测适用性以及与基因组DNA的可替代性等实验，研制转基因筛查检测用质粒DNA标准分子pUC-soy-identification。结果显示，制备的质粒标准分子测序结果与靶标序列完全一致，酶切结果、qPCR扩增结果等均符合预期，鲑鱼精DNA更能使拷贝数比值接近理论值。在基因特异性、适用性、互换性检测中的应用符合阳性对照要求，表明制备的阳性质粒标准分子可用于转基因大豆DBN9004、DBN8002、SHZD32-1、中黄6106和CAL16及其加工产品的定量检测，为我国转基因生物安全管理和标识制度的实施提供了有效的技术支撑。

关键词: 转基因大豆, 质粒标准分子, 适用性, 特异性

Abstract:

Soybeans are rich in plant proteins and edible oils， and also provide beneficial nutrients such as isoflavones and lecithin， making them important crops for food， feed， and oil production. China's demand for and import volume of soybeans have increased year by year， with import dependence at times exceeding 80%. Five transgenic soybean events （DBN9004， DBN8002， SHZD32-1， ZH6106， and CAL16）， which were independently developed in China and have obtained biosafety certificates for genetically modified organisms， were used as research objects. On the basis of the standard qualitative and quantitative detection methods for each transgenic event and its derivative varieties， the five transgenic soybean events and the endogenous standard gene Lectin were assembled into a binary vector. A series of experiments， including plasmid molecular verification， screening of plasmid preservation medium， method specificity validation， and detection applicability and interchangeability testing using genomic DNA， was then carried out to develop the plasmid DNA reference molecule pUC-soy-identification for transgenic screening. The results showed that the sequence of the prepared plasmid reference molecule was completely consistent with the target sequence， and both restriction enzyme digestion and qPCR amplification produced the expected results. The addition of salmon sperm DNA helped bring the copy number ratio closer to the theoretical value. The plasmid preparation met the specified criteria for use as a positive control in specificity， applicability， and interchangeability tests targeting DBN9004， DBN8002， SHZD32-1， ZH6106， and CAL16. Therefore， the resulting plasmid reference molecule can be applied to the quantitative detection of the aforementioned transgenic soybeans and their processed products， and provides a robust technical tool for the biosafety management and labeling compliance of genetically modified organisms in China.

Key words: transgenic soybean, plasmid reference materials, applicability, specificity

中图分类号:

Q-33

刘鹏飞, 刘娜, 李瑞环, 付伟, 徐超, 兰青阔, 王永, 赵新. 转基因大豆多靶标筛查质粒DNA标准分子的研制[J]. 生物技术进展, 2026, 16(4): 863-877.

Pengfei LIU, Na LIU, Ruihuan LI, Wei FU, Chao XU, Qingkuo LAN, Yong WANG, Xin ZHAO. Development of Multi-target Plasmid DNA Reference Materials for Screening Transgenic Soybeans[J]. Current Biotechnology, 2026, 16(4): 863-877.

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图/表 18

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靶标	引物序列（5′→3′）	产物大小/bp	来源
DBN9004	F：5′-TGCTTCCAATTTGCCACACGCTAGCAGTAACATTGATC-3′	433	自行设计
DBN9004	R：5′-GTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCAAGCTCAAGC-3′	433	自行设计
DBN8002	F：5′-TGGTTGATGGAGAGGAGGGTGGCGCCTGGCCGTATCCGC-3′	267	自行设计
DBN8002	R：5′-GTTAAACAATAGAAATTAAAAAAACCTAACAACAAATGTCTTGATTTTAAAGAC-3′	267	自行设计
SHZD32-1	F：5′-CAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGC-3′	208	自行设计
SHZD32-1	R：5′-GCGGATACGGCCAGGCGCCACCCTCCTCTCCATCAACC-3′	208	自行设计
中黄6106	F：5′-GCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAAC-3′	250	自行设计
中黄6106	R：5′-GCTGCTCTAGCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3′	250	自行设计
CAL16	F：5′-GTCTTTAAAATCAAGACATTTGTTGTTAGGTTTTTTTAATTTCTATTGTTTAAC-3′	213	自行设计
CAL16	R：5′-CAAGAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCCAC-3′	213	自行设计
Lectin	F：5′-GTGGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTCTTG-3′	118	自行设计
Lectin	R：5′-AGGAAACAGCTATGACCATGCTCGAGCCAAGCTCGGCGCG-3′	118	自行设计

靶标	引物序列（5′→3′）	产物大小/bp	来源
DBN9004	F：5′-TGCTTCCAATTTGCCACACGCTAGCAGTAACATTGATC-3′	433	自行设计
DBN9004	R：5′-GTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCAAGCTCAAGC-3′	433	自行设计
DBN8002	F：5′-TGGTTGATGGAGAGGAGGGTGGCGCCTGGCCGTATCCGC-3′	267	自行设计
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SHZD32-1	F：5′-CAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGC-3′	208	自行设计
SHZD32-1	R：5′-GCGGATACGGCCAGGCGCCACCCTCCTCTCCATCAACC-3′	208	自行设计
中黄6106	F：5′-GCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAAC-3′	250	自行设计
中黄6106	R：5′-GCTGCTCTAGCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3′	250	自行设计
CAL16	F：5′-GTCTTTAAAATCAAGACATTTGTTGTTAGGTTTTTTTAATTTCTATTGTTTAAC-3′	213	自行设计
CAL16	R：5′-CAAGAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCCAC-3′	213	自行设计
Lectin	F：5′-GTGGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTCTTG-3′	118	自行设计
Lectin	R：5′-AGGAAACAGCTATGACCATGCTCGAGCCAAGCTCGGCGCG-3′	118	自行设计

靶标	引物/探针序列（5′→3′）	产物大小/bp	来源
DBN9004	F：5′-AACGCGGCCGCTCTAG-3′	165	待发布国家标准
	R：5′-ATTATGTGGAAAGAAATGACCGAAA-3′
	P：5′-CGCCGGGTCCCGTTTAAACTATCAGT-3′
DBN8002	F：5′-TATCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3′	110	待发布国家标准
	R：5′-ATGGGACACTTGAGGAATGACA-3′
	P：5′-TGTGTAACGCTTGTTTTGCTAT-3′
SHZD32-1	F：5′-TCGTTTCCCGCCATAAGG-3′	120	农业农村部864号公告—15—2024
	R：5′-CATCAACCAAGAGCAACAGCAT-3′
	P：5′-FAM-TCCGACCACCACGAGACCGTAGTACA-BHQ1-3′
中黄6106	F：5′-TCTAAGCGTCAATTTGTTTACATCA-3′	96	农业农村部864号公告—16—2024
	R：5′-AAAGGTGTGAAATGTGAACGC-3′
	P：5′-FAM-TTACCTAAAACATCTCAGCACATCGC-BHQ1-3′
CAL16	F：5′-GTTGCTACATGTTGACTGATTATTTCTTT-3′	112	待发布国家标准
	R：5′-CGCAATGTGTTATTAAGTTGTCCACTA-3′
	P：5′-FAM- CTCATTGATAAAAGATAAGCC -MGB-3′
Lectin	F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′	118	农业部2031号公告—8—2013
	R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′
	P：5′-HEX-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3′

靶标	引物/探针序列（5′→3′）	产物大小/bp	来源
DBN9004	F：5′-AACGCGGCCGCTCTAG-3′	165	待发布国家标准
	R：5′-ATTATGTGGAAAGAAATGACCGAAA-3′
	P：5′-CGCCGGGTCCCGTTTAAACTATCAGT-3′
DBN8002	F：5′-TATCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3′	110	待发布国家标准
	R：5′-ATGGGACACTTGAGGAATGACA-3′
	P：5′-TGTGTAACGCTTGTTTTGCTAT-3′
SHZD32-1	F：5′-TCGTTTCCCGCCATAAGG-3′	120	农业农村部864号公告—15—2024
	R：5′-CATCAACCAAGAGCAACAGCAT-3′
	P：5′-FAM-TCCGACCACCACGAGACCGTAGTACA-BHQ1-3′
中黄6106	F：5′-TCTAAGCGTCAATTTGTTTACATCA-3′	96	农业农村部864号公告—16—2024
	R：5′-AAAGGTGTGAAATGTGAACGC-3′
	P：5′-FAM-TTACCTAAAACATCTCAGCACATCGC-BHQ1-3′
CAL16	F：5′-GTTGCTACATGTTGACTGATTATTTCTTT-3′	112	待发布国家标准
	R：5′-CGCAATGTGTTATTAAGTTGTCCACTA-3′
	P：5′-FAM- CTCATTGATAAAAGATAAGCC -MGB-3′
Lectin	F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′	118	农业部2031号公告—8—2013
	R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′
	P：5′-HEX-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3′

	1次	2次	3次	4次	5次	6次	平均值	SD	RSD
OD₂₆₀/OD₂₈₀	1.81	1.86	1.82	1.84	1.88	1.82	1.84	0.03	0.01
OD₂₆₀/OD₂₃₀	2.10	2.03	2.07	2.09	2.11	2.02	2.07	0.04	0.02
QuantiFluor染料法浓度/（ng·μL^-1）	133.10	132.70	133.90	136.80	135.60	134.80	134.48	1.56	0.01

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靶标	保存介质	冻融次数	酵母tRNA	鲑鱼精DNA	0.1×TE
DBN9004	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	0次	5 900	10 677	1 600
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		5 737	10 600	1 733
	DBN9004转化体Lectin拷贝数比值/%		1.03	1.01	0.93
	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	10次	5 233	10 233	1 700
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 000	10 233	1 700
	DBN9004转化体Lectin拷贝数比值/%		0.87	1.00	1.01
DBN8002	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	0次	7 067	11 833	2 333
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		7 233	11 833	2 467
	DBN8002转化体Lectin拷贝数比值/%		0.98	1.00	0.96
	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	10次	6 300	11 600	2 000
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 867	10 767	2 033
	DBN8002转化体Lectin拷贝数比值/%		0.92	0.98	1.00
CAL16	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	0次	5 900	10 933	1 567
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 133	10 600	1 700
	CAL16转化体Lectin拷贝数比值/%		0.96	1.03	0.94
	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	10次	5 433	10 300	1 500
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 133	10 300	2 033
	CAL16转化体Lectin拷贝数比值/%		0.89	1.00	0.75
SHZD32-1	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	0次	6 100	10 567	1 900
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 167	10 500	1 533
	SHZD32-1转化体Lectin拷贝数比值/%		0.99	1.01	1.30
	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	10次	5 600	9 967	1 967
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 300	10 167	2 067
	SHZD32-1转化体Lectin拷贝数比值/%		0.89	0.98	0.98
中黄6106	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	0次	6 867	11 267	1 767
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 733	10 933	1 933
	中黄6106转化体Lectin拷贝数比值/%		1.02	1.03	0.92
	转化体特异性序列拷贝数/(copies·μL^-1)	10次	6 300	10 200	1 600
	内标拷贝数/(copies·μL^-1)		6 677	10 467	2 300
	中黄6106转化体Lectin拷贝数比值/%		0.95	0.97	0.70

		Lectin	DBN9004	DBN8002	中黄6106	SHZD32-1	CAL16
决定系数（R²）	1	0.999	0.996	0.998	0.999	0.999	0.996
	2	0.995	0.998	0.998	0.998	0.999	0.999
	3	0.996	0.999	0.991	0.994	0.998	0.994
	平均值	0.997	0.998	0.996	0.997	0.999	0.996
	RSD	0.21	0.15	0.41	0.27	0.06	0.25
斜率	1	-3.329	-3.152	-3.456	-3.143	-3.233	-3.559
	2	-3.340	-3.163	-3.462	-3.185	-3.197	-3.384
	3	-3.401	-3.197	-3.392	-3.192	-3.250	-3.403
	平均值	-3.357	-3.171	-3.437	-3.173	-3.227	-3.449
	RSD	-1.16	-0.74	-1.13	-0.84	-0.84	-2.78
PCR扩增效率	1	99.7	101.6	98.7	100.5	100.8	95.6
	2	99.4	100.1	100.6	98.3	97.5	97.5
	3	96.9	98.1	97.1	100.9	98.1	96.7
	平均值	98.68	99.93	98.80	99.90	98.80	96.60
	RSD	1.54	1.76	1.77	1.40	1.78	0.99

质粒DNA各靶标标准曲线参数		基因组DNA各靶标标准曲线
质粒DNA各靶标标准曲线参数		Lectin	DBN9004	DBN8002	中黄6106	SHZD32-1	CAL16
R²	Lectin	0.538
	DBN9004		0.101
	DBN8002			0.451
	中黄6106				0.882
	SHZD32-1					0.051
	CAL16						0.214
斜率	Lectin	0.125
	DBN9004		0.861
	DBN8002			0.055
	中黄6106				0.215
	SHZD32-1					0.373
	CAL16						0.547
扩增效率（E）	Lectin	0.756
	DBN9004		0.696
	DBN8002			0.504
	中黄6106				0.589
	SHZD32-1					0.307
	CAL16						0.387

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[3]	周泽汇, 张辰, 沈荣妍, 吴轲, 刘娜, 李瑞环, 王雅偲, 王成, 徐超, 赵新, 兰青阔, 王永, 齐欣, 裴忠有. 基于核酸质谱的转基因水稻多靶标检测方法[J]. 生物技术进展, 2026, 16(4): 805-821.
[4]	田锦, 高芳瑞, 李玲, 陈子言, 陈一帆, 张华, 陈红, 王颢潜, 梁晋刚. 转基因玉米Bt11特异性定性PCR检测方法的建立[J]. 生物技术进展, 2025, 15(6): 1031-1039.
[5]	张月秋, 傅芳奇, 张华, 陈一帆, 王晨尧, 蒋红叶, 李亚辉, 廖一尘, 王丹, 孙宇, 付伟, 陈红. 转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体实时荧光定量PCR检测方法的研究[J]. 生物技术进展, 2025, 15(2): 276-286.
[6]	李永超, 杨昭. 双特异抗体药物研发现状及发展对策[J]. 生物技术进展, 2023, 13(3): 353-358.
[7]	王颢潜, 黄炎, 石雨婷, 朱鹏宇, 谢宇宙, 黄春蒙, 卢小雨, 付伟. 转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用[J]. 生物技术进展, 2023, 13(1): 83-89.
[8]	王思雅, 韩雨灏, 李针保, 张婷婷, 梁佳欣, 林卉丰, 张淑华. 一种基于配体肽的CRP荧光检测探针的研制[J]. 生物技术进展, 2022, 12(3): 405-410.
[9]	杨懿祺, 张志高, 游小龙, 张婧, 林冠峰, 吴英松. 抗体药物的发展与应用[J]. 生物技术进展, 2022, 12(3): 358-365.
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靶标		Lectin	DBN9004	DBN8002	中黄6106	SHZD32-1	CAL16
决定系数（R²）	1	0.999	0.994	0.993	0.999	0.996	0.992
	2	0.996	0.996	0.991	0.997	0.993	0.995
	3	0.998	0.996	0.996	0.994	0.995	0.994
	平均值	0.998	0.995	0.993	0.997	0.995	0.994
	RSD	0.150	0.120	0.250	0.250	0.150	0.150
斜率	1	-3.321	-3.193	-3.345	-3.061	-3.125	-3.436
	2	-3.313	-3.151	-3.286	-3.180	-3.179	-3.395
	3	-3.330	-3.178	-3.387	-3.095	-3.250	-3.400
	平均值	-3.321	-3.174	-3.339	-3.112	-3.185	-3.410
	RSD	-0.260	-0.670	-1.520	-1.970	-1.970	-0.660
PCR扩增效率	1	99.40	98.90	96.90	100.90	99.80	96.80
	2	99.10	100.20	99.60	97.50	99.400	97.10
	3	96.20	99.30	97.10	99.10	101.3	97.80
	平均值	98.23	99.47	97.87	99.17	100.17	97.23
	RSD	1.80	0.67	1.54	1.72	1.00	0.53

靶标		Lectin	DBN9004	DBN8002	中黄6106	SHZD32-1	CAL16
决定系数（R²）	1	0.999	0.994	0.993	0.999	0.996	0.992
	2	0.996	0.996	0.991	0.997	0.993	0.995
	3	0.998	0.996	0.996	0.994	0.995	0.994
	平均值	0.998	0.995	0.993	0.997	0.995	0.994
	RSD	0.150	0.120	0.250	0.250	0.150	0.150
斜率	1	-3.321	-3.193	-3.345	-3.061	-3.125	-3.436
	2	-3.313	-3.151	-3.286	-3.180	-3.179	-3.395
	3	-3.330	-3.178	-3.387	-3.095	-3.250	-3.400
	平均值	-3.321	-3.174	-3.339	-3.112	-3.185	-3.410
	RSD	-0.260	-0.670	-1.520	-1.970	-1.970	-0.660
PCR扩增效率	1	99.40	98.90	96.90	100.90	99.80	96.80
	2	99.10	100.20	99.60	97.50	99.400	97.10
	3	96.20	99.30	97.10	99.10	101.3	97.80
	平均值	98.23	99.47	97.87	99.17	100.17	97.23
	RSD	1.80	0.67	1.54	1.72	1.00	0.53