转基因玉米KJ1003实时荧光PCR定性检测方法

doi:10.19586/j.2095-2341.2026.0027

生物技术进展 ›› 2026, Vol. 16 ›› Issue (4): 833-842.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2026.0027

转基因玉米KJ1003实时荧光PCR定性检测方法

赵桐桐(), 陈子言, 张华, 裴欣瑶, 王晨尧, 李佳岢, 王丹, 张月秋, 付伟(), 陈红()

农业农村部科技发展中心，北京 100176

收稿日期:2026-02-06 接受日期:2026-04-03 出版日期:2026-07-25 发布日期:2026-09-11
通信作者: 付伟,陈红
作者简介:赵桐桐 E-mail: 2981382909@qq.com
基金资助:
农业生物育种重大专项(2022ZD040201101)

A Qualitative Detection Method for Genetically Modified Maize KJ1003 by Real-time PCR

Tongtong ZHAO(), Ziyan CHEN, Hua ZHANG, Xinyao PEI, Chenyao WANG, Jiake LI, Dan WANG, Yueqiu ZHANG, Wei FU(), Hong CHEN()

Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China

Received:2026-02-06 Accepted:2026-04-03 Online:2026-07-25 Published:2026-09-11
Contact: Wei FU,Hong CHEN

摘要/Abstract

摘要：

转基因玉米KJ1003是科稷达隆（北京）生物技术有限公司研发的玉米转化体，具有良好抗虫耐除草剂性能，已获得转基因生物安全证书，产业化前景良好。选取KJ1003转化体特征特异性序列作为检测靶点，经引物探针筛选、反应体系优化及特异性、灵敏度、检出限和稳定性试验，并结合8家实验室协同验证，最终构建了适用于KJ1003转化体的荧光PCR定性检测方法。结果表明，该检测方法可特异性扩增158 bp特异性片段，灵敏度与检出限均为0.05%，稳健性良好；8家实验室对方法特异性、检出限、再现性的验证结果均符合相关标准的要求。研究结果为我国对转基因作物的检测和安全监管提供了科学依据和技术支撑。

关键词: 转基因玉米, 抗虫耐除草剂, KJ1003, 实时荧光PCR, 定性检测

Abstract:

The genetically modified maize line KJ1003 is a transformation event developed by Kejidalong （Beijing） Biotechnology Co.， Ltd. It exhibits excellent insect resistance and herbicide tolerance， has obtained a genetically modified organism safety certificate， and possesses promising industrialization prospects. In this study， a real-time fluorescent PCR qualitative detection method for the KJ1003 transformation event was established， targeting the specific sequence of KJ1003 through primer and probe design and screening， reaction system optimization， as well as specificity， sensitivity， limit of detection， and robustness tests， together with inter-laboratory validation. The results showed that this method could effectively detect KJ1003 transgenic components and amplify a 158 bp specific fragment， with a detection sensitivity and limit of detection both reaching 0.05% and favorable robustness. The verification results of the method′s specificity， limit of detection and reproducibility conducted by 8 laboratories all complied with relevant standard requirements. This study provides a scientific basis and technical support for the detection and safety supervision of genetically modified crops in China.

Key words: genetically modified maize, insect-tolerant and herbicide-tolerant, KJ1003, real-time PCR, qualitative detection

中图分类号:

Q789

赵桐桐, 陈子言, 张华, 裴欣瑶, 王晨尧, 李佳岢, 王丹, 张月秋, 付伟, 陈红. 转基因玉米KJ1003实时荧光PCR定性检测方法[J]. 生物技术进展, 2026, 16(4): 833-842.

Tongtong ZHAO, Ziyan CHEN, Hua ZHANG, Xinyao PEI, Chenyao WANG, Jiake LI, Dan WANG, Yueqiu ZHANG, Wei FU, Hong CHEN. A Qualitative Detection Method for Genetically Modified Maize KJ1003 by Real-time PCR[J]. Current Biotechnology, 2026, 16(4): 833-842.

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图/表 11

表1 样品信息

Table 1 Sample information

转基因混合样品	组成成分（每种转化体质量分数1%）
其他转基因玉米混合样	Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、DAS40278-9、4114、MON87427、5307、DBN9858、ND207、DBN9501、瑞丰125、DBN9936、MON87411、MZIR098、浙大瑞丰8、BFL4-2、nCX-1
转基因大豆混合样	GTS40-3-2、MON89788、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、FG72、DAS81419-2、DAS-444Ø6-6、MON87751、SHZD3201、CAL16、中黄6106、DBN9004
转基因水稻混合样	TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1、T1C-19
转基因油菜混合样	MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy-235、Topas19/2、MON88302、73496
转基因棉花混合样	MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102
非转基因玉米混合样	多种非转基因玉米等量混合制成

表2 定性PCR引物和探针序列

Table 2 Sequences of qualitative PCR primers and probes

引物和探针（5′端）	序列（5′→3′）	引物和探针（3′端）	序列（5′→3′）
RB-qF1	5′-CGTGTCCTCGCTCCCTTTTC-3′	LB-qF1	5′-CGCGTGAATACGTAGCTGTG-3′
RB-qF2	5′-GCTCCCTTTTCTCTTCCCCAA-3′	LB-qF2	5′-TGTGAAAAGAGAACGCGTGAAT-3′
RB-qF3	5′-GTCCTCGCTCCCTTTTCTCTT-3′	LB-qF3	5′-TGTGTCCCAAGTAAACCTCAGT-3′
RB-qR1	5′-ATAGCGCGCAAACTAGGATAAA-3′	LB-qR1	5′-CCCAAGTCCCACTCCTTGTG-3′
RB-qR2	5′-AGCGCGCAAACTAGGATAA-3′	LB-qR2	5′-AACCGGACCGTGGTGTTTT-3′
RB-qR3	5′-ATAGCGCGCAAACTAGGAT-3′	LB-qR3	5′-GCGCGTAAGTCTTGGTCTTC-3′
RB-qP1	5′-FAM-CAGATTGTCGTTTCCCGCCT-BHQ1-3′	LB-qP1	5′-FAM-GTGGCTCTAGCCGCTCCCAG-BHQ1-3′
RB-qP2	5′-FAM-TGTCGTTTCCCGCCTTCAGT-BHQ1-3′	LB-qP2	5′-FAM-CTCTAGCCGCTCCCAGTCGA-BHQ1-3′

表3 定性PCR引物和探针组合

Table 3 Combinations of qualitative PCR primers and probes

编号	引物名称及序列（5′→3′）	产物大小/bp
组合1	RB-qF1/RB-qR1/RB-qP1	161
组合2	RB-qF1/RB-qR1/RB-qP2	161
组合3	RB-qF2/RB-qR2/RB-qP1	150
组合4	RB-qF2/RB-qR2/RB-qP2	150
组合5	RB-qF3/RB-qR3/RB-qP1	158
组合6	RB-qF3/RB-qR3/RB-qP2	158
组合7	RB-qF1/RB-qR2/RB-qP1	159
组合8	RB-qF1/RB-qR2/RB-qP2	159
组合9	LB-qF1/LB-qR1/LB-qP1	188
组合10	LB-qF1/LB-qR1/LB-qP2	188
组合11	LB-qF2/LB-qR2/LB-qP1	176
组合12	LB-qF2/LB-qR2/LB-qP2	200
组合13	LB-qF3/LB-qR3/LB-qP1	200
组合14	LB-qF3/LB-qR3/LB-qP2	200
组合15	LB-qF2/LB-qR1/LB-qP1	200
组合16	LB-qF2/LB-qR1/LB-qP2	200

图1 KJ1003转化体16对引物探针组合实时荧光PCR扩增结果A：Bio-Rad CFX96 PCR仪，Go Taq? Green Master Mix；B：Bio-Rad CFX96 PCR仪，TaqManTM Fast Advanced Master Mix；C：Abi QuantStudio 3 PCR仪，Go Taq? Green Master Mix。1—空白对照、阴性对照；2、3—KJ1003转化体拷贝数比值1%样品

Fig. 1 Real-time fluorescent PCR amplification results of KJ1003 transformant using 16 primer-probe combinations

图2 初步筛选引物探针组合特异性测试注：1—空白对照、阴性对照、其他转基因玉米混合样品、转基因大豆混合样品、转基因水稻混合样品、转基因油菜混合样品、转基因棉花混合样品、非转基因玉米混合样品样品；2—阳性对照、KJ1003转化体拷贝数比值1% KJ1003玉米。

Fig. 2 Preliminary screening of primer-probe combinations for specificity test

图3 候选引物探针和内标准基因zSSIIb引物探针浓度优化A：KJ1003转化体（拷贝数比值1%）候选引物探针浓度优化。1—空白对照、阴性对照，引物/探针浓度为0.4 μmol·L-1/0.2 μmol·L-1；2—引物/探针浓度为0.2 μmol·L-1/0.1 μmol·L-1；3—阳性对照，引物/探针浓度为0.4 μmol·L-1/0.2 μmol·L-1；4—引物/探针浓度为0.6 μmol·L-1/0.3 μmol·L-1；5—引物/探针浓度为0.8 μmol·L-1/0.4 μmol·L-1。B：玉米内标准基因zSSIIb（拷贝数比值1%）引物探针浓度优化。6—引物/探针浓度为0.4 μmol·L-1/0.16 μmol·L-1；7—引物/探针浓度为0.4 μmol·L-1/0.2 μmol·L-1

Fig. 3 Optimization of primer-probe concentrations for candidate primer-probes and endogenous reference gene zSSIIb

图4 候选引物探针特异性测试注：1—空白对照、阴性对照、其他转基因玉米混合样品、转基因大豆混合样品、转基因水稻混合样品、转基因油菜混合样品、转基因棉花混合样品、非转基因玉米混合样品；2—KJ1003转化体拷贝数比值1%样品；3—阳性对照（KJ1003转化体拷贝数比值5%样品）。

Fig. 4 Specificity test of candidate primer-probes

图5 灵敏度测试扩增图注：1~6—0.2%/80 copies、0.1%/40 copies、0.05%/20 copies、0.025%/10 copies、0.005%/2 copies、0.002 5%/1 copy。

Fig. 5 Amplification curves for the sensitivity test

图6 检出限测试扩增图注：1—空白对照、阴性对照、其他转基因玉米混合样品、转基因大豆混合样品、转基因水稻混合样品、转基因油菜混合样品、转基因棉花混合样品、非转基因玉米混合样品；2—KJ1003转化体拷贝数比值0.05%样品。

Fig. 6 Amplification curves for the limit of detection test

图7 稳健性测试扩增图A：操作人员1，Bio-Rad CFX96 PCR仪器测试结果；B：操作人员2，Thermo Fisher QuantStudio 3 PCR仪测试结果。1—空白对照、阴性对照；2—检出限样品；3—KJ1003拷贝数比值1%样品。

Fig. 7 Amplification curves for robustness test

表4 KJ1003转化体特异性实时荧光PCR定性检测方法验证结果汇总表

Table 4 Summary of verification results for event-specific real-time fluorescent PCR qualitative detection method of KJ1003 transformant

样品名称	8家实验室验证结果
样品名称	Lab1	Lab2	Lab3	Lab4	Lab5	Lab6	Lab7	Lab8
空白对照	-	-	-	-	-	-	-	-
阴性对照	-	-	-	-	-	-	-	-
阳性对照	+	+	+	+	+	+	+	+
1% KJ1003	+	+	+	+	+	+	+	+
其他转基因玉米混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因大豆混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因水稻混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因油菜混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因棉花混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
非转基因玉米混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
0.05%KJ1003（检出限）	+	+	+	+	+	+	+	+

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A Qualitative Detection Method for Genetically Modified Maize KJ1003 by Real-time PCR

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