转基因玉米Bt11特异性定性PCR检测方法的建立

doi:10.19586/j.2095-2341.2025.0058

生物技术进展 ›› 2025, Vol. 15 ›› Issue (6): 1031-1039.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2025.0058

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转基因玉米Bt11特异性定性PCR检测方法的建立

田锦¹^,²(), 高芳瑞¹, 李玲², 陈子言¹, 陈一帆³, 张华¹, 陈红¹(), 王颢潜¹, 梁晋刚¹()

^1.农业农村部科技发展中心，北京 100176
^2.北京农业职业学院食品与生物工程学院，北京 102442
^3.上海市农业科学院生物技术研究所，上海 201106

收稿日期:2025-04-30 接受日期:2025-08-13 出版日期:2025-11-25 发布日期:2026-01-04
通讯作者: 陈红,梁晋刚
作者简介:田锦 E-mail: 73466@bvca.edu.cn
基金资助:
农业生物育种国家科技重大专项(2022ZD04019);农业农村部农业国家和行业标准制修订项目(农质标函〔2022〕66号);农业农村部农业科研杰出人才培养计划项目

Establishment of Specific Qualitative PCR Detection Method of Transgenic Maize Bt11

Jin TIAN¹^,²(), Fangrui GAO¹, Ling LI², Ziyan CHEN¹, Yifan CHEN³, Hua ZHANG¹, Hong CHEN¹(), Haoqian WANG¹, Jingang LIANG¹()

^1.Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China
^2.College of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China
^3.Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China

Received:2025-04-30 Accepted:2025-08-13 Online:2025-11-25 Published:2026-01-04
Contact: Hong CHEN,Jingang LIANG

摘要/Abstract

摘要：

研究旨在建立一套用于精准检测转基因抗虫玉米Bt11的特异性定性PCR检测方法，以满足转基因生物安全管理的需求，确保转基因玉米产品的安全性和真实性。采用QIAGEN DNeasy^? Plant Maxi kit提取Bt11基因组DNA，基于Bt11外源基因插入片段侧翼序列设计并筛选特异性引物。通过调整退火温度和引物浓度，进行特异性、检出限和再现性测试，优化检测条件。最终选择Bt11-RB-F3/R3引物组合，确定退火温度为60 ℃，引物浓度为0.4 μmol·L^-1。该引物组合能特异性扩增260 bp的目标片段，且无非特异性扩增。在拷贝数比值为0.1%的样品中，该方法可稳定检出Bt11转化体，检出限为0.1%。再现性测试表明，不同操作人员、不同时间段和不同PCR仪的检测结果一致，符合预期。研究成功建立了一种科学、可靠的Bt11转基因玉米检测方法，能够精准、高效地检测Bt11转化体，为转基因生物安全管理机构提供了强有力的技术支持，对加强转基因生物安全监管体系具有重要意义。

关键词: 转基因玉米, Bt11, 定性PCR技术, 特异性检测

Abstract:

This study aims to establish a specific qualitative PCR detection method for the precise identification of the Bt11 transgenic insect-resistant maize， in order to meet the requirements of biosafety management of genetically modified （GM） organisms and ensure the safety and authenticity of GM maize products. The genomic DNA of Bt11 was extracted using the QIAGEN DNeasy^? Plant Maxi kit， and specific primers were designed and screened based on the flanking sequences of the inserted foreign gene segment in Bt11. The detection conditions were optimized by adjusting the annealing temperature and primer concentration， specificity， detection limit， and reproducibility of the method were tested. The primer pair Bt11-RB-F3/R3 was ultimately selected， with an annealing temperature of 60 ℃ and a primer concentration of 0.4 μmol·L^-1. The selected primer pair Bt11-RB-F3/R3 specifically amplified a 260 bp target fragment without any non-specific amplification. The method was able to stably detect the Bt11 transgenic event in samples with a copy number ratio of 0.1%， establishing a detection limit of 0.1%. The reproducibility test demonstrated that the detection results across different operators， time periods， and PCR instruments are consistent and meet the expected outcomes. This study successfully established a scientific and reliable detection method for Bt11 transgenic maize， which is capable of precisely and efficiently identifying the Bt11 transgenic event. This method provides strong technical support for biosafety management institutions and holds significant importance for strengthening the regulatory system of GM biosafety.

Key words: genetically modified maize, Bt11, qualitative PCR, specific detection

中图分类号:

田锦, 高芳瑞, 李玲, 陈子言, 陈一帆, 张华, 陈红, 王颢潜, 梁晋刚. 转基因玉米Bt11特异性定性PCR检测方法的建立[J]. 生物技术进展, 2025, 15(6): 1031-1039.

Jin TIAN, Fangrui GAO, Ling LI, Ziyan CHEN, Yifan CHEN, Hua ZHANG, Hong CHEN, Haoqian WANG, Jingang LIANG. Establishment of Specific Qualitative PCR Detection Method of Transgenic Maize Bt11[J]. Current Biotechnology, 2025, 15(6): 1031-1039.

图/表 10

图1 Bt11插入位点整合和定位示意图

Fig. 1 Integration and mapping schematic of the Bt11 insertion site

表1 Bt11转化体普通PCR引物序列信息表

Table 1 Primer sequence information for conventional PCR of Bt11 event

引物名称	序列(5´→3´)	引物名称	序列(5´→3´)
Bt11-LB-F1	5´-ATGGCTATTTTCAAGGTCGCT-3´	Bt11-RB-F2	5´-ACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3´
Bt11-LB-F2	5´-AATCCGTAGGTGTAGCCTCTAGT-3´	Bt11-RB-F3	5´-ACTAGATCTGGGCCTCGTGA-3´
Bt11-LB-F3	5´-CATCGACTTCCATGACCAAA-3´	Bt11-RB-F4	5´-TACTAGATCTGGGCCTCGT-3´
Bt11-LB-R1	5´-TTTCTACGGGGTCTGACGCT-3´	Bt11-RB-R1	5´-CGAGCCTCTGGTCGATGATA-3´
Bt11-LB-R2	5´-TGGTAGCTCTTGATCCGGCA-3´	Bt11-RB-R2	5´-ATGTGGGGTGAGGTGTACGA-3´
Bt11-LB-R3	5´-CGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3´	Bt11-RB-R3	5´-TTTTGATGAAAATAGCCATGAG-3´
Bt11-LB-R4	5´-AACAAACCACCGCTGGTAGC-3´	Bt11-RB-R4	5´-GAGGCTAACACCTACAGATTTTAGA-3´
Bt11-LB-R5	5´-GTATCTGCGCTCTGCTGAAG-3´	Bt11-RB-R5	5´-CTCCACCAAAAATCCAAGAATC-3´
(S1)Bt11-F	5´-GCCTCGTGATACGCCTATTTTT-3´	(S2)Bt11-F	5´-GCGGAACCCCTATTTGTTTA-3´
(S1)Bt11-R	5´-CAAAAATCCAAGAATCCCTCCA-3´	(S2)Bt11-R	5´-CAAGAAATGGTCTCCACCAAA-3´
Bt11-RB-F1	5´-AGACGTCAGGTGGCACTTTT-3´

表2 候选引物组合

Table 2 Candidate primer pairs

序号	组合	产物大小/bp	序号	组合	产物大小/bp	序号	组合	产物大小/bp
1	Bt11-LB-F1/R1	133	15	Bt11-RB-F1/R4	152	29	Bt11-RB-F4/R5	181
2	Bt11-LB-F1/R2	243	16	Bt11-RB-F1/(S2)Bt11-R	126	30	Bt11-RB-F4/(S2)Bt11-R	192
3	Bt11-LB-F1/R4	223	17	Bt11-RB-F2/R1	221	31	Bt11-RB-F4/(S1)Bt11-R	175
4	Bt11-LB-F1/R5	286	18	Bt11-RB-F2/R2	238	32	(S2)Bt11-F/Bt11-RB-R1	202
5	Bt11-LB-F2/R1	176	19	Bt11-RB-F2/R3	181	33	(S2)Bt11-F/Bt11-RB-R2	219
6	Bt11-LB-F2/R2	286	20	Bt11-RB-F2/R4	138	34	(S2)Bt11-F/Bt11-RB-R3	162
7	Bt11-LB-F2/R3	160	21	Bt11-RB-F3/R1	300	35	(S1)Bt11-R/Bt11-RB-R1	289
8	Bt11-LB-F2/R4	266	22	Bt11-RB-F3/R3	260	36	(S1)Bt11-R/Bt11-RB-R3	249
9	Bt11-LB-F3/R2	179	23	Bt11-RB-F3/R4	217	37	(S1)Bt11-R/Bt11-RB-R4	206
10	Bt11-LB-F3/R4	159	24	Bt11-RB-F3/R5	180	38	(S1)Bt11-R/Bt11-RB-R5	169
11	Bt11-LB-F3/R5	222	25	Bt11-RB-F3/(S2)Bt11-R	191	39	(S1)Bt11-R/(S2)Bt11-R	180
12	Bt11-RB-F1/R1	235	26	Bt11-RB-F3/(S1)Bt11-R	174	40	(S1)Bt11-R/(S1)Bt11-F	163
13	Bt11-RB-F1/R2	252	27	Bt11-RB-F4/R3	261
14	Bt11-RB-F1/R3	195	28	Bt11-RB-F4/R4	218

表3 特异性测试样品

Table 3 Specificity test samples

序号	样品名称	样品组成	样品状态
1	空白对照	水	—
2	阴性对照	抗虫玉米Bt11非转基因对照玉米基因组DNA	植株叶片
3	阳性对照	抗虫玉米Bt11转化体基因组DNA，拷贝数分数为1%	植株叶片
4	其他转基因玉米混合样	本实验室制备^[12]	粉末
5	转基因大豆混合样	本实验室制备^[12]	粉末
6	转基因水稻混合样	本实验室制备^[12]	粉末
7	转基因油菜混合样	本实验室制备^[12]	粉末
8	转基因棉花混合样	本实验室制备^[12]	粉末

图2 Bt11转化体检测引物组合筛选注：M—DL1000 marker；1~2孔—空白对照；3~4孔—阴性对照；5~6孔—1% BT11；7~8孔—0.1% BT11。

Fig. 2 Screening of the primers group for PCR detecting Bt11 event

图3 Bt11转化体反应条件优化注：M—DL1000 maker；1—空白对照；2—阴性对照；3—1.0 μmol·L-1；4—0.8 μmol·L-1；5—0.6 μmol·L-1；6—0.4 μmol·L-1；7—0.2 μmol·L-1；8—0.1 μmol·L-1。

Fig. 3 Optimization of reaction conditions of Bt11 event

图4 Bt11转化体PCR特异性测试注：M—DL1000 marker；1、1′—空白对照；2~8分别对应2′~8′样品的内标准基因。2、3、8—玉米内标准基因zSSIIb扩增片段151 bp；4—水稻内标准基因SPS扩增片段287 bp；5—棉花内标准基因SadI扩增片段282 bp；6—大豆内标准基因Lectin扩增片段210 bp；7—油菜内标准基因HMG I/Y扩增片段206 bp。2′—Bt11非转基因对照玉米；3′—1% Bt11；4′—转基因水稻混样；5′—转基因棉花混样；6′—转基因大豆混样；7′—转基因油菜混样；8′—其他转基因玉米混样。

Fig. 4 Specificity PCR test of Bt11 event

图5 Bt11转化体PCR检测方法检出限初测注：1~9为玉米内标准基因扩增电泳图；1′~9′为Bt11转化体电泳图；M—DL1000 marker；1、1′—空白对照；2、2′—阴性对照；3、3′—100% Bt11；4、4′—10% Bt11；5、5′—1% Bt11；6、6′—0.5% Bt11；7、7′—0.1% Bt11；8、8′—0.05% Bt11；9、9′—0.01% Bt11。

Fig. 5 Preliminary determination of the detection limit for the PCR method of Bt11 event

图6 Bt11转化体检出限测试A：玉米内标准基因扩增电泳图；M—DL1000 marker；1—阴性对照；2—空白对照；3~63—0.1% Bt11转化体；B：Bt11转化体特异性序列扩增电泳图；1~2—阴性对照；3~4—空白对照；5~64—0.1% Bt11转化体。

Fig. 6 Quantitative limit test for Bt11 event

图7 Bt11转化体再现性测试A~B:2位实验人员分别用内标准基因引物和候选引物对阴性样品、拷贝数比值为1%的样品和检出限样品的重复测试结果

Fig. 7 Reproducibility test for Bt11 event

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