Research of Detection Method for Genetically Modified Herbicide-tolerant Soyabean LP012-1 Transformant by Quantitative Real-time PCR

doi:10.19586/j.2095-2341.2024.0208

Current Biotechnology ›› 2025, Vol. 15 ›› Issue (2): 276-286.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2024.0208

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Research of Detection Method for Genetically Modified Herbicide-tolerant Soyabean LP012-1 Transformant by Quantitative Real-time PCR

Yueqiu ZHANG¹(), Fangqi FU¹(), Hua ZHANG¹, Yifan CHEN², Chenyao WANG¹, Hongye JIANG¹, Yahui LI³, Yichen LIAO¹, Dan WANG¹, Yu SUN², Wei FU¹(), Hong CHEN¹()

^1.Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China
^2.Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201199，China
^3.Institute of Food Safety and Nutrition，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China

Received:2024-12-27 Accepted:2025-02-12 Online:2025-03-25 Published:2025-04-29
Contact: Wei FU,Hong CHEN

转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体实时荧光定量PCR检测方法的研究

张月秋¹(), 傅芳奇¹(), 张华¹, 陈一帆², 王晨尧¹, 蒋红叶¹, 李亚辉³, 廖一尘¹, 王丹¹, 孙宇², 付伟¹(), 陈红¹()

^1.农业农村部科技发展中心，北京　100176
^2.上海市农业科学院，上海　201199
^3.江苏省农业科学院，农产品质量安全与营养研究所，南京 210014

通讯作者: 付伟,陈红
作者简介:张月秋 E-mail: zhangyueqiu903@163.com；
傅芳奇 E-mail: 2570167864@qq.com
基金资助:
农业生物育种国家科技重大专项(2022ZD04020)

Abstract

Abstract:

The standardized genetically modified detection's method provides important technical support for the industrial application and quantitative identification system implementation of biological breeding. Based on the left boundary of the foreign insertion sequence， a quantitative real-time PCR （qPCR） detection method was established with the genetically modified soybean LP012-1 with genetically modified herbicide-tolerant soyabean selected as the research object. The target sequence of the left boundary of the foreign insertion sequence was designed as the primer and its corresponding probe， and the optimal primer combination was selected by screening. The primer and probe concentrations and annealing temperature were optimized， and the linear dynamic range was determined to be from 0.018 to 100 ng. The detection limit and the quantitative limit were 0.05% and 0.10%， respectively. The correctness， precision， robustness， and joint validation error between laboratories were less than 25%. The qPCR detection method established in this study has good specificity， high sensitivity， and strong robustness， which can provide technical support for the safety supervision of transgenic soybean LP012-1 and serve the commercialization of biological breeding.

Key words: genetically modified soyabean, quantitative real-time PCR, LP012-1 transformant

摘要：

转化体标准化检测方法为生物育种产业化的应用和定量标识制度实施提供了重要的技术支撑。基于插入序列左边界的信息，以耐除草剂大豆LP012-1转化体为研究对象，建立了实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测方法。以外源插入序列位点左边界为靶标序列设计引物及其相应的探针，筛选获得了最优的引物组合，并优化引物探针浓度和退火温度，确定线性动力学范围在0.018~100 ng，检出限和定量限分别为0.05%、0.10%；正确度、精密度、实验室内稳健性和实验室间的联合验证误差均小于25%。研究建立的qPCR检测方法特异性好、灵敏度高、稳健性强，可以为耐除草剂转基因大豆LP012-1的安全监管提供技术支撑，并服务于生物育种商业化。

关键词: 转基因大豆, 实时荧光定量PCR, LP012-1转化体

CLC Number:

Yueqiu ZHANG, Fangqi FU, Hua ZHANG, Yifan CHEN, Chenyao WANG, Hongye JIANG, Yahui LI, Yichen LIAO, Dan WANG, Yu SUN, Wei FU, Hong CHEN. Research of Detection Method for Genetically Modified Herbicide-tolerant Soyabean LP012-1 Transformant by Quantitative Real-time PCR[J]. Current Biotechnology, 2025, 15(2): 276-286.

张月秋, 傅芳奇, 张华, 陈一帆, 王晨尧, 蒋红叶, 李亚辉, 廖一尘, 王丹, 孙宇, 付伟, 陈红. 转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体实时荧光定量PCR检测方法的研究[J]. 生物技术进展, 2025, 15(2): 276-286.

Figures/Tables 16

References 22

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样品	成分	混合方式
转基因大豆混合样	中黄6106、GTS40-3-2、MON89788、FG72、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、CAL16、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、DAS81419-2、DAS-444Ø6-6、MON87751、SHZD3201、DBN9004	转化体混合物质量分数为1%
转基因玉米混合样	MON810、MON863、GA21、NK603、Bt11、Bt176、T25、MON89034、MON88017、59122、MIR604、DBN9501、瑞丰125、MON87460、DAS40278-9、4114、MON87427、5307、3272、DBN9858、ND207、DBN9936、MON87411、MZIR098、浙大瑞丰8、BFL4-2、TC1507、nCX-1	转化体混合物质量分数为1%
转基因水稻混合样	TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1、T1C-19	转化体混合物质量分数为1%
转基因油菜混合样	MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302、73496	10个转化体混合物质量分数为1%
转基因棉花混合样	MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102	转化体混合物质量分数为1%

样品	成分	混合方式
转基因大豆混合样	中黄6106、GTS40-3-2、MON89788、FG72、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、CAL16、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、DAS81419-2、DAS-444Ø6-6、MON87751、SHZD3201、DBN9004	转化体混合物质量分数为1%
转基因玉米混合样	MON810、MON863、GA21、NK603、Bt11、Bt176、T25、MON89034、MON88017、59122、MIR604、DBN9501、瑞丰125、MON87460、DAS40278-9、4114、MON87427、5307、3272、DBN9858、ND207、DBN9936、MON87411、MZIR098、浙大瑞丰8、BFL4-2、TC1507、nCX-1	转化体混合物质量分数为1%
转基因水稻混合样	TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1、T1C-19	转化体混合物质量分数为1%
转基因油菜混合样	MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302、73496	10个转化体混合物质量分数为1%
转基因棉花混合样	MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102	转化体混合物质量分数为1%

5′端引物和探针	序列（5′→3′）	3′端引物和探针	序列（5′→3′）
LP012-1-LB-QF1	5′-TCCGCAATGTGTTATTAAG-3′	LP012-1-RB-QF1	5′-CTGGAATAATCTCAATGACA-3′
LP012-1-LB-QF2	5′-CGCAATGTGTTATTAAGTTG-3′	LP012-1-RB-QF2	5′-CAAGCTGGAATAATCTCAA-3′
LP012-1-LB-QR1	5′-CCTCTTCTTACTAATATTCCTTTA-3′	LP012-1-RB-QF3	5′-AGCTGGAATAATCTCAATG-3′
LP012-1-LB-QR2	5′-CTGGATCACAACTTACCTA-3′	LP012-1-RB-QR1	5′-GCCTTCAGTTTAAACTATCA-3′
LP012-1-LB-QP1	5′-FAM-TGCTCTGGATCACAACTTACCTAA-BHQ1-3′	LP012-1-RB-QP1	5′-FAM-CTTCCACCGTTTCTGTTCCTTC-BHQ1-3′
LP012-1-LB-QP2	5′-FAM-CACACTATGCCTGACCTATCTCA-BHQ1-3′	LP012-1-RB-QP2	5′-FAM-CTGCTTCCACCGTTTCTGTTC-BHQ1-3′
LP012-1-LB-QP3	5′-FAM-ACACTATGCCTGACCTATCTCAATT-BHQ1-3′

5′端引物和探针	序列（5′→3′）	3′端引物和探针	序列（5′→3′）
LP012-1-LB-QF1	5′-TCCGCAATGTGTTATTAAG-3′	LP012-1-RB-QF1	5′-CTGGAATAATCTCAATGACA-3′
LP012-1-LB-QF2	5′-CGCAATGTGTTATTAAGTTG-3′	LP012-1-RB-QF2	5′-CAAGCTGGAATAATCTCAA-3′
LP012-1-LB-QR1	5′-CCTCTTCTTACTAATATTCCTTTA-3′	LP012-1-RB-QF3	5′-AGCTGGAATAATCTCAATG-3′
LP012-1-LB-QR2	5′-CTGGATCACAACTTACCTA-3′	LP012-1-RB-QR1	5′-GCCTTCAGTTTAAACTATCA-3′
LP012-1-LB-QP1	5′-FAM-TGCTCTGGATCACAACTTACCTAA-BHQ1-3′	LP012-1-RB-QP1	5′-FAM-CTTCCACCGTTTCTGTTCCTTC-BHQ1-3′
LP012-1-LB-QP2	5′-FAM-CACACTATGCCTGACCTATCTCA-BHQ1-3′	LP012-1-RB-QP2	5′-FAM-CTGCTTCCACCGTTTCTGTTC-BHQ1-3′
LP012-1-LB-QP3	5′-FAM-ACACTATGCCTGACCTATCTCAATT-BHQ1-3′

序号	组合（3′端）	产物大小/bp	序号	组合（5′端）	产物大小/bp
1	LP012-1-LB-QF1/QR1/QP1	185	9	LP012-1-LB-QF3/QR2/QP3	96
2	LP012-1-LB-QF1/QR2/QP2	122	10	LP012-1-LB-QF4/QR1/QP1	142
3	LP012-1-LB-QF1/QR2/QP3	122	11	LP012-1-RB-QF1/QR1/QP1	195
4	LP012-1-LB-QF2/QR1/QP1	183	12	LP012-1-RB-QF1/QR1/QP2	195
5	LP012-1-LB-QF2/QR2/QP2	120	13	LP012-1-RB-QF2/QR1/QP1	199
6	LP012-1-LB-QF2/QR2/QP3	120	14	LP012-1-RB-QF2/QR1/QP2	199
7	LP012-1-LB-QF3/QR1/QP1	159	15	LP012-1-RB-QF3/QR1/QP1	197
8	LP012-1-LB-QF3/QR2/QP2	96	16	LP012-1-RB-QF3/QR1/QP2	197

Research of Detection Method for Genetically Modified Herbicide-tolerant Soyabean LP012-1 Transformant by Quantitative Real-time PCR

转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体实时荧光定量PCR检测方法的研究

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样品编号	反应体系中DNA含量/ng	大豆Lectin基因拷贝数	LP012-1转化体拷贝数
G1	100.00	83 200.00	83 200.00
G2	13.16	10 947.37	10 947.37
G3	1.73	1 440.44	1 440.44
G4	0.23	189.53	189.53
G5	0.03	24.94	24.94
G6	0.018	15.00	15.00

含量理论值	各平行子样转基因含量			平均值	相对偏倚	标准差	相对标准差
含量理论值	子样1	子样2	子样3	平均值	相对偏倚	标准差	相对标准差
5%	4.44%	4.66%	5.51%	4.87%	2.63%	0.63%	12.90%
1%	1.14%	0.89%	1.11%	1.05%	4.34%	0.15%	14.11%
0.1%	0.11%	0.11%	0.10%	0.11%	4.93%	0.01%	10.06%

重复	LP012-1转化体拷贝数	Lectin基因拷贝数	百分比/%
1	37 520.00	33.62	0.090
2	35 980.00	23.09	0.064
3	44 360.00	40.03	0.090
4	41 000.00	42.81	0.104
5	52 860.00	47.97	0.091
6	41 520.00	36.86	0.089
7	39 300.00	35.70	0.091
8	38 430.00	39.53	0.103
9	46 010.00	31.25	0.068
10	51 680.00	61.01	0.118
11	45 280.00	49.10	0.108
12	42 470.00	48.06	0.113
13	49 740.00	55.37	0.111
14	39 470.00	28.40	0.072
15	53 090.00	56.77	0.107
16	48 880.00	36.44	0.075
平均值	44 224	42	0.093
相对偏倚/%	-	-	-6.626
标准偏差/%	-	-	0.017
相对标准偏差/%	-	-	18.169

因素	平行子样3次重复转化体拷贝数平均值与内标准基因拷贝数平均值比值%					正确度%	标准差%	精密度%
因素	子样1	子样2	子样3	子样均值	平均值	正确度%	标准差%	精密度%
其他操作者	0.11	0.10	0.11	0.11	0.11	5.17	0.006	6.16
	0.11	0.10	0.12	0.11
	0.09	0.09	0.12	0.10
其他试剂盒	0.11	0.11	0.12	0.11	0.11	9.99	0.005	4.26
	0.10	0.12	0.10	0.11
	0.12	0.09	0.12	0.11
其他仪器	0.08	0.12	0.10	0.10	0.10	1.33	0.004	3.89
	0.10	0.11	0.09	0.10
	0.11	0.11	0.10	0.10

实验室	不同含量样品标称转基因含量/%
实验室	5.0	3.0	1.0	0.5	0.1
1	5.61	3.24	1.13	0.56	0.11
2	5.46	2.85	1.14	0.55	0.09
3	4.98	2.97	1.16	0.58	0.12
4	5.02	3.19	1.17	0.58	0.12
5	5.13	3.13	0.96	0.47	0.09
6	4.71	2.55	0.96	0.51	0.10
7	5.35	3.17	1.10	0.53	0.11
8	5.65	3.20	1.01	0.50	0.10
RSD%	6.98	8.48	8.49	8.31	11.24