遗传性胆红素代谢障碍与胆汁淤积NGS方法的建立及应用

doi:10.19586/j.2095-2341.2022.0128

生物技术进展 ›› 2022, Vol. 12 ›› Issue (4): 591-599.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2022.0128

遗传性胆红素代谢障碍与胆汁淤积NGS方法的建立及应用

宋燚¹(), 贾思雨², 武丽娜³, 张伟³, 欧晓娟³, 黄坚¹()

^1.首都医科大学附属北京友谊医院临床医学研究所，北京 100050
^2.北京大学人民医院麻醉科，北京 100044
^3.首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心，北京 100050

收稿日期:2022-06-28 接受日期:2022-07-08 出版日期:2022-07-25 发布日期:2022-08-10
通讯作者: 黄坚
作者简介:宋燚 E-mail: songmiaoxi@126.com;
基金资助:
国家自然科学基金项目(82000543);北京市医院管理中心消化内科学科协同发展中心项目(XXX0101)

Establishment and Application of NGS Method for Inherited Disorders of Hyperbilirubinemia and Cholestasis

Yi SONG¹(), Siyu JIA², Lina WU³, Wei ZHANG³, Xiaojuan OU³, Jian HUANG¹()

^1.Institute of Clinical Medicine，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China
^2.Department of Anesthesiology，Peking University People's Hospital，Beijing 100044，China
^3.Liver Research Center，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Received:2022-06-28 Accepted:2022-07-08 Online:2022-07-25 Published:2022-08-10
Contact: Jian HUANG

摘要/Abstract

摘要：

为快速准确、低成本、高通量地检测我国人群常见的遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征，选择了10个易感基因的全部外显子及内含子剪切区的SNP/CNV，建立了基于二代测序技术（next generation sequencing, NGS）的靶向捕获测序方法。通过6例已知突变位点的样本对该方法的准确性进行验证，准确率为100%。收集首都医科大学附属北京友谊医院遗传性胆红素代谢障碍及胆汁淤积综合征患者39例进行检测，共检测到58种突变。检测结果与HGMD、ClinVar、OMIM突变数据库比较，未报道的突变通过千人基因组数据集对比并按照哈温平衡检验（HWE_P＞0.05）和χ^２ 检验确定新突变19种。检测到的不同突变类型有效地揭示了该类疾病的遗传多样性。NGS方法的建立及应用为临床诊断提供了新的技术手段。

关键词: 遗传性胆红素代谢障碍, 胆汁淤积, 二代测序技术, 靶向捕获

Abstract:

In order to detect the common inherited disorders of hyperbilirubinemia and cholestasis syndrome in Chinese population more quickly， accurately， at lower cost and in higher throughput， the SNPs/CNVs of all exons and introns of ten susceptible genes were selected， and a targeted capture sequencing method based on next-generation sequencing （NGS） technology was established. The accuracy of this method was verified by six samples of known mutation sites， and the accuracy rate was 100%. The 39 patients with inherited disorders of hyperbilirubinemia and cholestasis syndrome were collected from Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University. A total of 58 mutations were detected. The test results were compared with HGMD， ClinVar and OMIM mutation databases. The unreported mutations were compared using the international genome sample resource and according to the Hardy-Weinberg equilibrium （HWE_P>0.05） and chi-square test. 19 new mutations were identified. The different mutation types detected effectively reveal the genetic diversity of this disease. The establishment and application of NGS method provides a new technical means for clinical diagnosis.

Key words: inherited disorders of hyperbilirubinemia, cholestasis, next-generation sequencing technology, targeted capture

中图分类号:

Q789

宋燚, 贾思雨, 武丽娜, 张伟, 欧晓娟, 黄坚. 遗传性胆红素代谢障碍与胆汁淤积NGS方法的建立及应用[J]. 生物技术进展, 2022, 12(4): 591-599.

Yi SONG, Siyu JIA, Lina WU, Wei ZHANG, Xiaojuan OU, Jian HUANG. Establishment and Application of NGS Method for Inherited Disorders of Hyperbilirubinemia and Cholestasis[J]. Current Biotechnology, 2022, 12(4): 591-599.

图/表 7

参考文献 20

1	MEMON N, WEINBERGER B I, HEGYI T, et al.. Inherited disorders of bilirubin clearance[J]. Pediatr. Res., 2016, 79(3): 378-386.
2	STICOVA E, JIRSA M. New insights in bilirubin metabolism and their clinical implications[J]. World J. Gastroenterol., 2013, 19(38): 6398-6407.
3	WAGNER K H, SHIELS R G, LANG C A, et al.. Diagnostic criteria and contributors to Gilbert's syndrome[J]. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 2018, 55(2): 129-139.
4	CREEDEN J F, GORDON D M, STEC D E, et al.. Bilirubin as a metabolic hormone: the physiological relevance of low levels[J]. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2021, 320(2): E191-E207.
5	BUESING K L, TRACY E T, KIERNAN C, et al.. Partial splenectomy for hereditary spherocytosis: a multi-institutional review[J]. J. Pediatr. Surg., 2011, 46(1): 178-183.
6	WANG N L, LU Y, GONG J Y, et al.. Molecular findings in children with inherited intrahepatic cholestasis[J]. Pediatr. Res., 2020, 87(1): 112-117.
7	AOKI H, OGIWARA K, HASEGAWA M, et al.. Hemostatic rebalance in neonatal intrahepatic cholestasis with citrin deficiency[J/OL]. Pediatr. Int., 2021, 64(1): e14741[2022-06-08]. .
8	KAMATH B M, STEIN P, HOUWEN R H J, et al.. Potential of ileal bile acid transporter inhibition as a therapeutic target in Alagille syndrome and progressive familial intrahepatic cholestasis[J]. Liver Int., 2020, 40(8): 1812-1822.
9	GIOVANNONI I, CALLEA F, BELLACCHIO E, et al.. Genetics and molecular modeling of new mutations of familial intrahepatic cholestasis in a single Italian center[J/OL]. PLoS ONE, 2015, 10(12): 0145021[2022-06-08]..
10	GRACE R F, BARCELLINI W. Management of pyruvate kinase deficiency in children and adults[J]. Blood, 2020, 136(11): 1241-1249.
11	WOOD A M, LIVINGSTON E G, HUGHES B L, et al.. Intrahepatic cholestasis of pregnancy: a review of diagnosis and management[J]. Obstet. Gynecol. Surv., 2018, 73(2): 103-109.
12	LIN J, GU W, HOU Y. Diagnosis and prognosis of early-onset intrahepatic cholestasis of pregnancy: a prospective study[J]. J. Matern. Fetal. Neonatal. Med., 2019, 32(6): 997-1003.
13	WANG N L, LU Y L, ZHANG P, et al.. A specially designed multi-gene panel facilitates genetic diagnosis in children with intrahepatic cholestasis: simultaneous test of known large insertions/deletions[J/OL]. PLoS ONE, 2016, 11(10): 0164058[2022-06-08]..
14	CHEN H L, LI H Y, WU J F, et al.. Panel-based next-generation sequencing for the diagnosis of cholestatic genetic liver diseases: clinical utility and challenges[J]. J. Pediatr., 2019, 205: 153-159.
15	詹春雷, 万盛华, 李娜,等. 血浆氨基酸谱变化在Citrin缺陷致新生儿肝内胆汁淤积症诊断中的价值[J]. 中华实用儿科临床杂志, 2020, 35(14): 1076-1080.
16	SMITH D D, ROOD K M. Intrahepatic cholestasis of pregnancy[J]. Clin. Obstet. Gynecol., 2020, 63(1): 134-151.
17	SHAO Y, CHEN S, HI L, et al.. Maternal bile acid profile and subtype analysis of intrahepatic cholestasis of pregnancy[J/OL]. Orphanet. J. Rare. Dis., 2021, 16(1): 021-01887[2022-06-08]. .
18	TOGAWA T, SUGIURA T, ITO K, et al.. Molecular genetic dissection and neonatal/infantile intrahepatic cholestasis using targeted next-generation sequencing[J]. J. Pediatr., 2016, 171: 171-177.
19	ABRAMOVS N, BRASS A, TASSABEHJI M. Hardy-Weinberg equilibrium in the large scale genomic sequencing era[J/OL]. Front. Genet., 2020, 11:210[2022-07-15]..
20	刘红, 胡永华. 遗传流行病学研究中的H-W平衡检验[J]. 中南大学学报(医学版), 2010, 35(1): 90-93.

易感基因	疾病信息	目标区域类型	起始位置	终止位置	目标区域探针个数
ATP8B1	良性复发型肝内胆汁淤积，进行性家族性肝内胆汁淤积症1型	CDS+splice region	55315698	55399065	136
ABCB11	进行性家族性肝内胆汁淤积症2型	CDS+splice region	169780116	169874654	124
ABCB4	进行性家族性肝内胆汁淤积症 3型	CDS+splice region	87031398	87104818	149
UGT1A1	Gilbert综合征和Crigler-Najjar综合征	CDS+splice region	234668914	234681236	54
JAG1	Alagille综合征	CDS+splice region	10620125	10654270	148
ABCC2	Dubin-Johnson综合征	CDS+splice region	101542567	101611439	165
SLCO1B1	Rotor综合征	CDS+splice region	21294434	21392178	87
SLCO1B3	Rotor综合征	CDS+splice region	20968592	21069206	95
SLC25A13	Citrin 缺乏症	CDS+splice region	95750479	95951328	82
SERPINA1	α1-抗胰蛋白酶缺乏症	CDS+splice region	94844765	94849630	44

易感基因	疾病信息	目标区域类型	起始位置	终止位置	目标区域探针个数
ATP8B1	良性复发型肝内胆汁淤积，进行性家族性肝内胆汁淤积症1型	CDS+splice region	55315698	55399065	136
ABCB11	进行性家族性肝内胆汁淤积症2型	CDS+splice region	169780116	169874654	124
ABCB4	进行性家族性肝内胆汁淤积症 3型	CDS+splice region	87031398	87104818	149
UGT1A1	Gilbert综合征和Crigler-Najjar综合征	CDS+splice region	234668914	234681236	54
JAG1	Alagille综合征	CDS+splice region	10620125	10654270	148
ABCC2	Dubin-Johnson综合征	CDS+splice region	101542567	101611439	165
SLCO1B1	Rotor综合征	CDS+splice region	21294434	21392178	87
SLCO1B3	Rotor综合征	CDS+splice region	20968592	21069206	95
SLC25A13	Citrin 缺乏症	CDS+splice region	95750479	95951328	82
SERPINA1	α1-抗胰蛋白酶缺乏症	CDS+splice region	94844765	94849630	44

项目	测量值
平均总得率/Mb	208.12
平均总读长/bp	149
平均碱基质量	36.4
平均 Q30 碱基数百分比/%	96.07
平均 Q20 碱基数百分比/%	98.47
平均总基因组比对后碱基数/Mb	198.52
平均基因组比对率/%	99.63
比对到目标区域上的碱基数/Mb	181.8
比对到目标上的平均比例/%	99.31
平均30X覆盖度	100
平均碱基捕获率	86.34
目标区域平均深度（以总目标区域为分母）	184.2

项目	测量值
平均总得率/Mb	208.12
平均总读长/bp	149
平均碱基质量	36.4
平均 Q30 碱基数百分比/%	96.07
平均 Q20 碱基数百分比/%	98.47
平均总基因组比对后碱基数/Mb	198.52
平均基因组比对率/%	99.63
比对到目标区域上的碱基数/Mb	181.8
比对到目标上的平均比例/%	99.31
平均30X覆盖度	100
平均碱基捕获率	86.34
目标区域平均深度（以总目标区域为分母）	184.2

易感基因	染色体定位	突变形式	突变类型	该突变/总例数	正常人中频率
ATP8B1	chr18:55342156	c.1729A>G(p.I577V)	错义突变	1/39（0.026）	0.005
	chr18:55336626	c.2021T>C(p.M674T)	错义突变	1/39（0.026）	0.005
	chr18:55362421	c.922G>A(p.G308S)	错义突变	1/39（0.026）	4.061e-06
	chr18:55317591	c.3531+8G>T	剪接突变	3/39（0.0769）	4.0e-06
ABCB11	chr2:169830328	c.1331T>C.(p.V444A)	错义突变	16/39（0.410）	0.569
	chr2:169801131	c.2594C>T(p.A865V)	错义突变	2/39（0.051）	0.001
	chr2:169851971	c.499G>A(p.A167T)	错义突变	1/39（0.026）	8.186e-06
	chr2:169814596	c.2221G>A(p.V741I)	错义突变	1/39（0.026）	8.173e-06
	chr2:169820817	c.2077G>C(p.A693P)	错义突变	1/39（0.026）	1.792e-05
ABCB4	chr7:87069639	c.1436C>T(p.P479L)	错义突变	1/39（0.026）	8.13e-06
	chr7:87056178	c.1952C>A(p.T651N)	错义突变	1/39（0.026）	0.001
	chr7:87056176	c.1954A>G(p.R652G)	错义突变	1/39（0.026）	0.099
UGT1A1	chr2:234669144	c.211G>A(p.G71R)	错义突变	15/39（0.385）	0.022
	chr2:234669268	c.335C>G(p.T112R)	错义突变	1/39（0.026）	1.625e-05
	chr2:234676979	c.1198A>C(p.N400H)	错义突变	1/39（0.026）	4.102e-06
	chr2:234681059	c.1456T>G(p.Y486D)	错义突变	4/39（0.103）	0.000 2
	chr2:234676872	c.1082C>T(p.P364L)	错义突变	4/39（0.103）	0.001
JAG1	chr20:10639284	c.526G>A(p.V176I)	错义突变	2/39（0.0513）	0.000 4
JAG1	chr20:10622501	c.2612C>G(p.P871R)	错义突变	1/39（0.026）	0.064
ABCC2	chr10:101572833	c.2026G>C(p.G676R)	错义突变	1/39（0.026）	1.5e-05
	chr10:101571331	c.1939G>T(p.E647X)	翻译终止	1/39（0.026）	4.067e-06
	chr10:101578849	c.2443C>T(p.R815X)	翻译终止	2/39（0.051）	3.657e-05
	chr10:101603639	c.3825C>G(p.Y1275X)	翻译终止	1/39（0.026）	6.497e-05
SLCO1B1	chr12:21375289	c.1738C>T(p.R580X)	翻译终止	4/39（0.103）	0.002
	chr12:21329738	c.388A>G(p.N130D)	错义突变	17/39（0.436）	0.472
	chr12:21331549	c.521T>C(p.V174A)	错义突变	8/39（0.205）	0.133
	chr12:21329802	c.452A>G(p.N151S)	错义突变	1/39（0.026）	0.000 3
	chr12:21327652	c.359+9_359+10insA	剪接突变	4/39（0.103）	4.0e-06
SLCO1B3	chr12:21011480	c.334T>G(p.S84A)	错义突变	18/39（0.462）	0.809 4
	chr12:20968666-chr12:20968669	c.-7_-4del	剪接突变	1/39（0.026）	2.1e-04
	chr12:21015760	c.699G>A(p.M205I)	错义突变	18/39（0.462）	0.809
	chr12:21015372-21015373	c.508_509del(p.M142fs)	移码突变	1/39（0.026）	3.659e-05
	chr12:21011481	c.335C>A(p.S84Y)	错义突变	4/39（0.103）	0.001
	chr12:21013948	c.360-3C>T	剪接突变	6/39（0.1538）	0.002 3
SERPINA1	chr14:94844843	c.1200A>C(p.E400D)	错义突变	10/39（0.256）	0.278 0
	chr14:94849201	c.374G>A(p.R125H)	错义突变	4/39（0.103）	0.160
	chr14:94847415	c.710T>C(p.V237A)	错义突变	1/39（0.026）	0.209
	chr14:94844968	c.1075A>G(p.K359E)	错义突变	1/39（0.026）	0.0001
SLC25A13	chr7:95864108	c.328+6A>G	剪接突变	7/39（0.179）	0.258

遗传性胆红素代谢障碍与胆汁淤积NGS方法的建立及应用

Establishment and Application of NGS Method for Inherited Disorders of Hyperbilirubinemia and Cholestasis

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易感基因	染色体定位	突变形式	突变类型
ATP8B1	chr18:55328438	c.2675G>A(p.G892E)	错义突变
ABCB11	chr2:169825967	c.1904T>A(p.V635E)	错义突变
ABCB11	chr2:169788962	c.3138A>G(p.I1046M)	错义突变
ABCB4	chr7:87069062	c.1652C>T(p.P551L)	错义突变
ABCB4	chr7:87046787	c.2523C>A(p.N841K)	错义突变
UGT1A1	chr2:234669301	c.368T>G(p.L123R)	错义突变
	chr2:234680996	c.1393_1394insTGA:p.V465delinsVM	非移码插入
	chr2:234676937	c.1156G>T(p.V386F)	错义突变
ABCC2	chr10:101571317	c.1926del:p.(Ala642Alafs*16)	移码突变
	chr10:101578706	c.2433del:p.(Lys811Lysfs*22)	移码突变
	chr10:101595969	c.3536del:p.(Gln1179Argfs*5)	移码突变
	chr10:101591889-101591889	c.3258+1G>A	剪接突变
	chr10:101557089	c.867+1_867+2ins	剪接突变
	chr10:101572870	c.2063T>C(p.M688T)	错义突变
	chr10:101578592	c.2317A>G(p.R773G)	错义突变
SLCO1B1	chr12:21032460	c.1226A>G:p.(Lys409Arg)	错义突变
SLCO1B3	chr12:21033881	c.1424G>A(p.G475E)	错义突变
SLC25A13	chr7:95822344	c.615+5G>A	剪接突变
SLC25A13	chr7:95818885	c.848+8G>T	剪接突变

[1]	丁璇, 张祖英, 苏秀娟, 胡文冉. 通过辅助方法优化农杆菌介导的棉花胚尖遗传转化[J]. 生物技术进展, 2025, 15(3): 495-501.
[2]	王智, 胡广, 付伟, 彭萱子, 张永江, 翟俊峰. 基于文献计量的转基因植物及其产品核酸检测技术发展态势分析[J]. 生物技术进展, 2025, 15(3): 476-485.
[3]	高子雅, 皇甫秉欣, 李佳岢, 李昉倩, 马智昊, 庞洋, 梁晋刚, 贺晓云. 生物育种产业化风险识别及建议——基于种植者的实地调研[J]. 生物技术进展, 2025, 15(3): 456-465.
[4]	海萨·艾也力汗null, 焦飞, 刘鸿, 呼德拉提·阿那斯null, 沈玉帮. 联合GWAS和转录组分析挖掘与白斑狗鱼耐高温性状关联的SNP[J]. 生物技术进展, 2025, 15(3): 432-445.
[5]	邱冰月, 施家腾, 金静. siRNA基因治疗在肌腱损伤修复中的研究进展[J]. 生物技术进展, 2025, 15(3): 411-417.
[6]	崔兆惠, 郭玲, 沈旭东, 林毅, 翟丽丽. 酵母表达治疗性重组蛋白的研究进展[J]. 生物技术进展, 2025, 15(3): 380-387.
[7]	王彦杰, 邱波. P53基因在骨肉瘤中的作用与研究进展[J]. 生物技术进展, 2025, 15(2): 241-246.
[8]	罗焱, 洪琪, 梁乐怡, 余诗玥, 陈琼霞, 韩晓芳, 镇鸿燕. WIPI2基因过表达慢病毒载体的构建及表达[J]. 生物技术进展, 2025, 15(1): 135-141.
[9]	乔建, 曾帅, 张杨, 徐葛林. 重组胰蛋白酶在原代地鼠肾细胞组织分离中的应用[J]. 生物技术进展, 2025, 15(1): 152-157.
[10]	张青云, 马蕾, 胥华, 靳礼安, 邹俊杰, 王宝宝, 陈全家, 徐妙云. 根系木质素含量影响玉米耐盐性的机制研究[J]. 生物技术进展, 2025, 15(1): 67-77.
[11]	万令飞, 潘文婷, 雍雨婷, 李元帅, 赵悦, 阎新龙. 单细胞转录组测序技术在肝纤维化中的研究进展[J]. 生物技术进展, 2024, 14(5): 793-804.
[12]	范宏博, 胡良勇, 胡松青. 幽门螺杆菌ureC和23S rDNA数字PCR检测体系的建立[J]. 生物技术进展, 2024, 14(5): 868-874.
[13]	李凯, 付军, 陈锐, 陈笑芸, 李亮. 基于免扩增高通量测序的转基因定量检测方法研究[J]. 生物技术进展, 2024, 14(4): 610-617.
[14]	孙卓婧, 徐道青, 唐巧玲, 王维. 韩国转基因生物安全管理与发展现状[J]. 生物技术进展, 2024, 14(3): 360-367.
[15]	张佳聪, 鲁纪刚. 基于CRISPR/Cas9系统建立新吉富罗非鱼双等位基因敲除技术——以SLC24A5基因为例[J]. 生物技术进展, 2024, 14(3): 442-450.